Разработка экспериментальной ин витро модели инфекции вируса гепатита В
- РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИН ВИТРО МОДЕЛИ ИНФЕКЦИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА В
Целью исследования являлась разработка экспериментальной ин витро модели инфекции вируса гепатита В, которую после проведения оптимизации и валидации будет возможно использовать для скрининга на антивирусную активность библиотеки химических соединений, не показавших наличия цитотоксического эффекта в ходе предварительной оценки цитотоксичности библиотеки отобранной на основе виртуального скрининга
В ходе выполнения ПНИЭР была выбрана релевантная экспериментальная ин витро модель (включая выбор линии клеток и методов детекции), способная обеспечить проведение скрининга на антивирусную активность библиотек потенциальных ингибиторов развития вирусной инфекции. Также подготовлено теоретическое описание с обоснованием применимости предлагаемой модели для решения поставленных задач, а именно:
— обеспечения проведения скрининга потенциальных ингибиторов развития инфекции ВГВ;
— определения стадий и/или механизмов, на которых тестируемые ингибиторы развития инфекции ВГВ оказывают действие.
Для разработки экспериментальной ин витро модели инфекции вируса гепатита В была выбрана линия гепатомы человека HepG2, которая для способности к инфицированию ВГВ и поддержанию полного цикла его репликации ин витро стабильно трансфицирована геном NTCP. В качестве источника инфекционных вирусных частиц для инфицирования клеточной линии HepG2/NTCP была выбрана клеточная линия гепатомы человека HepAD38, несущая стабильно интегрированный геном вируса ВГВ под контролем тетрациклин-регулируемого промотора, и секретирующая вирусные частицы в культуральную среду в отсутствии терациклина.
В ходе разработки модели ин витро инфекции ВГВ вначале были подтверждены возможность детектировать HBeAg в надклеточной среде и наличие эффективной репликации ВГВ в клетках HepG2-NTCP, зараженных препаратом ВГВ, выделенным из супернатанта HepAD38. Этим было показано, что выбранная модель инфекции и метод детекции могут быть применены в дальнейшей работе после оптимизации и валидации для скрининга химических соединений потенциальных ингибиторов развития инфекции ВГВ.
В последующих этапах разработки модели ин витро инфекции ВГВ были подобраны оптимальные условия инфицирования клеток линии HepG2/NTCP препаратом ВГВ для осуществления возможности проведения скрининга, а именно:
— показана прямая дозовая зависимость концентрации HBeAg в супернатанте от количества внесенного препарата ВГВ и от времени развития инфекции и выбраны минимально приемлемые количество препарата ВГВ, необходимое для инфицирования, и время для обеспечения развития оптимального сигнала;
— показана возможность заражения клеток HepG2/NTCP препаратом ВГВ сразу после переноса в планшеты суспензии с клетками без ожидания прикрепления клеток в течение ночной инкубации;
— было показано, что увеличение концентрации ДМСО до 2% при добавлении препарата ВГВ не только не снижает выживаемость клеток, но и значительно увеличивает эффективность инфекции;
— было выбрано оптимальное количество вносимых клеток в каждую лунку 96-луночного планшета;
После подбора условий была проведена валидация метода в соответствии с выбранными на предыдущих этапах разработки модели параметрами с множественными повторами контролей наличия и отсутствия развития инфекции ВГВ.
Таким образом, были протестированы и выбраны оптимальные параметры и проведена валидация метода, показавшая пригодность данной модели для проведения скрининга библиотеки потенциальных ингибиторов развития вирусной инфекции.
- Проведение скрининга ин витро отобранных химических соединений
Отобранные на основе виртуального скрининга соединения были протестированы в разработанной in vitro модели с целью выбора химических соединений, проявляющих антивирусную активность и при этом не показавших наличия цитотоксического эффекта. Исследования проведены на культуре клеток гепатомы человека HepG2/NTCP, инфицируемой ВГВ, выделенной из клеток линии HepAD38. Антивирусную активность химических соединений оценивали в концентрации 10 мкМ.