Улучшаем качество жизни, создавая новые лекарства
RUS | ENG

Разработка экспериментальной ин витро модели инфекции вируса гепатита В

  1. РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИН ВИТРО МОДЕЛИ ИНФЕКЦИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА В

Целью исследования являлась разработка экспериментальной ин витро модели инфекции вируса гепатита В, которую после проведения оптимизации и валидации будет возможно использовать для скрининга на антивирусную активность библиотеки химических соединений, не показавших наличия цитотоксического эффекта в ходе предварительной оценки цитотоксичности библиотеки отобранной на основе виртуального скрининга

В ходе выполнения ПНИЭР была выбрана релевантная экспериментальная ин витро модель (включая выбор линии клеток и методов детекции), способная обеспечить проведение скрининга на антивирусную активность библиотек потенциальных ингибиторов развития вирусной инфекции. Также подготовлено теоретическое описание с обоснованием применимости предлагаемой модели для решения поставленных задач, а именно:

— обеспечения проведения скрининга потенциальных ингибиторов развития инфекции ВГВ;

— определения стадий и/или механизмов, на которых тестируемые ингибиторы развития инфекции ВГВ оказывают действие.

Для разработки экспериментальной ин витро модели инфекции вируса гепатита В была выбрана линия гепатомы человека HepG2, которая для способности к инфицированию ВГВ и поддержанию полного цикла его репликации ин витро стабильно трансфицирована геном NTCP. В качестве источника инфекционных вирусных частиц для инфицирования клеточной линии HepG2/NTCP была выбрана клеточная линия гепатомы человека HepAD38, несущая стабильно интегрированный геном вируса ВГВ под контролем тетрациклин-регулируемого промотора, и секретирующая вирусные частицы в культуральную среду в отсутствии терациклина.

В ходе разработки модели ин витро инфекции ВГВ вначале были подтверждены возможность детектировать HBeAg в надклеточной среде и наличие эффективной репликации ВГВ в клетках HepG2-NTCP, зараженных препаратом ВГВ, выделенным из супернатанта HepAD38. Этим было показано, что выбранная модель инфекции и метод детекции могут быть применены в дальнейшей работе после оптимизации и валидации для скрининга химических соединений потенциальных ингибиторов развития инфекции ВГВ.

В последующих этапах разработки модели ин витро инфекции ВГВ были подобраны оптимальные условия инфицирования клеток линии HepG2/NTCP препаратом ВГВ для осуществления возможности проведения скрининга, а именно:

— показана прямая дозовая зависимость концентрации HBeAg в супернатанте от количества внесенного препарата ВГВ и от времени развития инфекции и выбраны минимально приемлемые количество препарата ВГВ, необходимое для инфицирования, и время для обеспечения развития оптимального сигнала;

— показана возможность заражения клеток HepG2/NTCP препаратом ВГВ сразу после переноса в планшеты суспензии с клетками без ожидания прикрепления клеток в течение ночной инкубации;

—  было показано, что увеличение концентрации ДМСО до 2% при добавлении препарата ВГВ не только не снижает выживаемость клеток, но и значительно увеличивает эффективность инфекции;

— было выбрано оптимальное количество вносимых клеток в каждую лунку 96-луночного планшета;

После подбора условий была проведена валидация метода в соответствии с выбранными на предыдущих этапах разработки модели параметрами с множественными повторами контролей наличия и отсутствия развития инфекции ВГВ.

Таким образом, были протестированы и выбраны оптимальные параметры и проведена валидация метода, показавшая пригодность данной модели для проведения скрининга библиотеки потенциальных ингибиторов развития вирусной инфекции.

  1. Проведение скрининга ин витро отобранных химических соединений

Отобранные на основе виртуального скрининга соединения были протестированы в разработанной in vitro модели с целью выбора химических соединений, проявляющих антивирусную активность и при этом не показавших наличия цитотоксического эффекта. Исследования проведены на культуре клеток гепатомы человека HepG2/NTCP, инфицируемой ВГВ, выделенной из клеток линии HepAD38.  Антивирусную активность химических соединений оценивали в концентрации 10 мкМ.