Фенотипирование цитохрома P450

Экспериментальный метод по определению степени участия изоформ цитохрома печени в метаболизме препарата входит в панель тестов АДМЕ. Наиболее распространенными изоферментами, обеспечивющими окислительную биотрансформацию лекарств, являются: CYP1А2, CYP2С9, CYP2С19, CYP2D6 и CYP3A4. Знание особенностей метаболизма лекарственного средства определенными изоформами системы цитохрома Р450 является необходимым при прогнозировании возможных нежелательных явлений, вызванных лекарственным взаимодействием, которые могут приводить к изменению концентрации лекарственного средства или его метаболитов (включая активные или токсические метаболиты) в плазме крови и в области молекул-мишеней.

Цель данного исследования состоит в изучении вклада изоформ цитохрома 1А2, 3А4, 2С9, 2С19 и 2D6 в процесс метаболизма исследуемого препарата микросомами печени человека. Фенотипирование осуществляется путем селективного ингибирования этих ферментов специфическими препаратами: фурафиллином, кетоконазолом, сульфафеназолом, омепразолом и хинидином. Убыль тестируемого вещества в процессе 1 ч инкубации определяется с помощью ВЭЖХ-МС/МС анализа.

Краткое описание метода

Тестируемые вещества в концентрации 1 мкМ инкубируются с микросомами человека (0,5 мг/мл, BD Gentest) в присутствии НАДФН, в 2 повторах. Метаболизм изучают без добавления ингибиторов и с селективными ингибиторами изоформ цитохрома Р450 в концентрации 10 мкМ.

Реакцию останавливают во временные точки 0, 5, 15, 30, 45, 60 мин путем добавления ацетонитрила. После преципитации белков, определяют количество оставшегося тест- препарата в супернатантах с помощью ВЭЖХ-МС/МС анализа. Рассчитывают время полураспада (T_1/2), клиренс in vitro (CL_int) и оставшееся количество вещества (% от начального). По влиянию селективных ингибиторов на скорость исчезновения вещества делают вывод об изоформах P450, преимущественно задействованных в метаболизме.

Протокол фенотипирования цитохрома