Исследование ингибирования цитохромов (субстратный метод)

Цель исследования — изучение ингибирования 6-ти изоферментов цитохрома Р450 (CYP450) в микросомах печени человека, используя традиционные субстраты и ВЭЖХМС/МС анализ. Тестируемые вещества в концентрации 0,005-10 мкМ инкубируются с микросомами человека (0,25 мг/мл, BD Gentest) в присутствии НАДФН и смеси из 7 специфических субстратов в 96-луночных планшетах. Реакцию останавливают через 20 мин путем добавления ацетонитрила. Образующиеся метаболиты детектируют с помощью ВЭЖХ-МС/МС анализа. В результате определяют значения IC50 для цитохромов 1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2C8 и 3A4 (2 субстрата). В качестве контролей применяются известные специфические ингибиторы.

Протокол исследования ингибирования цитохромов (субстратный метод)

Изоформы CYP450

1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2C8, 3A4 (по требованию панель

изоформ может быть расширена)

Концентрация соединения

Число повторов

0-10 мкМ (6 концентраций)

1

Кофактор

НАДФН

 

Субстраты

Фенацетин (1А2), мидазолам и тестостерон (3А4), толбутамид (2С9), амодиахин (2С8), s-мефенитоин (2С19), декстрометорфан (2D6). По требованию

панель субстратов может быть изменена

 

Метаболиты

Ацетоминофен, 1-ОН-мидазолам, 6β-OH- тестостерон, 4-OHтолбутамид, N-десетил амодиахин,

4-OH-мефенитоин, декстрофан.

Метод анализа

ВЭЖХ-МС/МС

 

 

 

 

Контроли

мин — 100% ингибирования (смесь субстратов и кофактора без микросом);

макс — 0% ингибирования (смесь субстратов, кофактора и микросом);

бланк – контроль растворителя;

специфические ингибиторы (6 концентраций):

кетоконазол (3A4) 0-5 мкМ, хинидин (2D6) 0-1 мкМ, αнафтофлавон (1A2) 0-2,7 мкМ, флувоксамин (1A2, 2C19) 0-50 мкМ, кверцетин (2C8) 0-30 мкМ;

сульфафеназол (2C9) — 0-10 мкМ.

 

Анализируемые параметры

-% ингибирования;

-IC50 — концентрация, при которой активность фермента снижается на 50%

Число соединений в плашке

18 + 6 контролей

 

Изоформа

CYP

Субстрат

Концентрация

субстрата, мкМ

Ингибитор

Метаболит

1A2

Фенацетин

60

Флувоксамин

Ацетоминофен

1A2

Фенацетин

60

a-Нафтофлавон

Ацетоминофен

3A4

Мидазолам

3

Кетоконазол

1-ОН-мидазолам

3A4

Тестостерон

60

Кетоконазол

6β-OH-тестостерон

2C9

Толбутамид

100

Сульфафеназол

4-OH-толбутамид

2С8

Амодиахин

6

Кверцетин

N-десетил амодиахин

2C19

S-мефенитоин

50

Флувоксамин

4-OH-мефенитоин

2D6

Декстрометорфан

3

Хинидин

Декстрофан

ДЛЯ ЗАКАЗА ИССЛЕДОВАНИЙ:

Сизюхин Андрей Владимирович

Руководитель отдела продаж R&D сервисов, доклинические исследования

E-mail: sa@chemrar.ru

Тел.: +7 (495) 925-30-74 +доб.(538)

ОТПРАВИТЬ ЗАЯВКУ

    Ajax Call Form
    Loading...
    Translate »