Исследование ингибирования цитохромов (флуоресцентный метод)

Экспериментальный метод по изучению ингибирования цитохромов печени входит в панель тестов АДМЕ. Несмотря на разнообразие изоферментов цитохрома в организме человека, биотрансформация лекарственных средств происходит с участием преимущественно ограниченного количества основных представителей семейства P450: CYP1А2, CYP2С9, CYP2С19, CYP2D6 и CYP3A4. Более редкими являются изоформы 2Е1, 2В6, 1В1, 2С8 и другие. Знание особенностей метаболизма лекарственного средства определенными изоформами системы цитохрома Р450 является необходимым при прогнозировании возможных нежелательных явлений, вызванных лекарственным взаимодействием, которые могут приводить к изменению концентрации лекарственного средства или его метаболитов (включая активные или токсические метаболиты) в плазме крови, а, следовательно, в области молекул-мишеней. Для оценки влияния препаратов на активность цитохромов печени в процессе разработки лекарств широко используются тест- системы с рекомбинантными ферментами и флуоресцентными субстратами, а также микросомы с метаболическими субстратами и ВЭЖХ-МС/МС анализ.

Краткое описание метода

Цель исследования — определение влияния соединения на активность основных изоформ цитохромов Р450 – 1А2, 2С9, 2С19, 2D6, 3А4, 2Е1, 2В6 при помощи тест-систем Invitrogen с флуоресцентными субстратами. Одним из наиболее быстрых и удобных методов тестирования большого ряда соединений на ингибирование цитохромов является флуоресцентный метод с использованием Vivid® CYP450 Screening Kits фирмы Invitrogen. Данные флуоресцентные киты разработаны для каждой изоформы цитохрома, основаны на взаимодействии рекомбинантных ферментов (CYP450 Baculosomes®) и их специфических флуоресцентных субстратов (Vivid® Substrates). В результате метаболической реакции субстраты переходят в сильно флуоресцирующие продукты, которые детектируются флюориметром. Снижение флуоресцентного сигнала говорит о степени ингибирования активности цитохрома. Тестируемые вещества в концентрации 0,005-10 мкМ инкубируются с рекомбинантными ферментами, субстратами и системой регенерации НАДФН в 384- луночных планшетах. Измеряется флуоресценция продукта реакции, пропорциональная активности цитохрома, в результате определяют значения IC50. В качестве контролей применяются известные специфические ингибиторы.

Протокол исследования ингибирования цитохромов (флуоресцентный метод)