Исследование время-зависимого ингибирования цитохромов

Цель исследования — изучение время-зависимого ингибирования 6-ти изоферментов цитохрома Р450 (CYP450) в микросомах печени человека, используя традиционные субстраты и ВЭЖХ-МС/МС анализ. Время- зависимость ингибирования цитохромов определяют для изучения обратимости и механизма ингибирования.

Тестируемые вещества в концентрации 0,019-10 мкМ преинкубируются с микросомами человека (0,5 мг/мл, Xenotech H0610) в присутствии/без НАДФН в 96-луночных планшетах при 37 °С. После 30 минут преинкубации смесь разбавляется в 10 раз раствором, содержащим 7 специфических субстратов, для измерения остаточной активности ферментов и инкубируется. Реакцию останавливают ацетонитрилом через 15 мин после добавления субстратов. Образующиеся метаболиты детектируют с помощью ВЭЖХ-МС/МС анализа. В результате определяют значения ИК50 после предварительной инкубации в отсутствии и в присутствии НАДФН для цитохромов 1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2C8 и 3A4 (2 субстрата), и вычисляют отношение этих величин, что даёт сдвиг ИК50. В качестве контролей применяются известные специфические ингибиторы..

Протокол исследования время –зависимого ингибирования цитохромов

Изоформы CYP450

1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2C8, 3A4 (по требованию панель

изоформ может быть расширена)

Концентрация соединения

Число повторов/концентрацию

0,019-10 мкМ (6 концентраций, шаг 3,5)

1

Кофактор

НАДФН

 

Субстраты

Фенацетин (1А2), мидазолам и тестостерон (3А4), толбутамид (2С9), амодиахин (2С8), s-мефенитоин (2С19), декстрометорфан (2D6). По требованию

панель субстратов может быть изменена

 

Метаболиты

Ацетоминофен, 1-ОН-мидазолам, 6β-OH- тестостерон, 4- OH-толбутамид, N-десетил

амодиахин, 4-OH-мефенитоин, декстрофан.

Метод анализа

ВЭЖХ-МС/МС

 

 

 

 

 

Контроли

мин — 100% ингибирования (смесь субстратов и кофактора без микросом);

макс — 0% ингибирования (смесь субстратов, кофактора и микросом);

бланк – контроль растворителя;

специфические ингибиторы (6 концентраций): мифепристон (3A4) 0,019-10 мкМ, пароксетин (2D6) 0,0019-1 мкМ, фурафилин (1A2) 0,057-30 мкМ, тиклопидин (2C19) 0,019-10 мкМ, дезэтил-

амиодарон (2C8) 0,057-30 мкМ; тиениловая кислота

(2C9) – 0,0019-1 мкМ

 

Анализируемые параметры

Сдвиг ИК50 – величина, определяемая как отношение ИК50 (концентрация, при которой

активность фермента снижается на 50%) в отсутствие

и в присутствии НАДФН

Число соединений в плашке

6 + 6 контролей

 

Изоформа

CYP

Субстрат

Концентрация

субстрата, мкМ

Ингибитор

Метаболит

1A2

Фенацетин

50

Фурафилин

Ацетоминофен

3A4

Мидазолам

5

Мифепристон

1-ОН-мидазолам

3A4

Тестостерон

50

Мифепристон

6β-OH-тестостерон

2C9

Толбутамид

50

Тиениловая кислота

4-OH-толбутамид

2С8

Амодиахин

5

Дезэтиламиодарон

N-десетил амодиахин

2C19

S-мефенитоин

50

Тиклопидин

4-OH-мефенитоин

2D6

Декстрометорфан

5

Пароксетин

Декстрофан

ДЛЯ ЗАКАЗА ИССЛЕДОВАНИЙ:

Сизюхин Андрей Владимирович

Руководитель отдела продаж R&D сервисов, доклинические исследования

E-mail: sa@chemrar.ru

Тел.: +7 (495) 925-30-74 +доб.(538)

ОТПРАВИТЬ ЗАЯВКУ

    Ajax Call Form
    Loading...
    Translate »