Нанопоровое секвенирование коротких фрагментов ДНК выявляет вариации числа копий при раке

Сильная сторона нанопорового секвенирования — получение длинных ридов. Но авторы статьи в Nucleic Acids Research предлагают использовать нанопоры и для секвенирования коротких молекул ДНК, чтобы определять вариации числа копий генов в раковых клетках. Это важно для диагностики, прогноза и лечения. Исследователи из Мемориального онкологического центра Слоуна — Кеттеринга и университета Джонса Хопкинса применили платформу Oxford Nanopore Technologies (ONT) для анализа числа копий в раковых клетках.

Вариации числа копий генов (Copy Number Alterations, CNA) часто коррелируют с разными заболеваниями, включая рак. Определение CNA важно для диагностики, прогноза и терапии. Традиционно вариации числа копий анализировали с помощью хромосомного анализа (кариотипирования) и ДНК-FISH, но они имеют ограничения по чувствительности и/или разрешающей способности анализа. Секвенирование нового поколения лучше справляется с задачей. Так, информацию о CNA с высоким разрешением можно получить с помощью секвенирования коротких молекул. Подобные методы используют в крупных клиниках, но стоит это недешево, а сами клиники есть не везде.

Для определения нуклеотидной последовательности удобно использовать нанопоровые секвенаторы: они портативные, секвенирование относительно дешево. А еще они могут секвенировать очень длинные молекулы ДНК. Но именно поэтому количество прочтений (ридов) у нанопора невелико. Для анализа CNA может быть выгоднее использовать большое количество коротких прочтений (ридов), чем небольшое количество длинных.

Команда Майкла Шатца, компьютерного биолог из Университета Джонса Хопкинса предположила, что загрузка платформы ONT короткими фрагментами ДНК позволит получить достаточное количество ридов для покрытия 1х или даже 0,1х — такого покрытия достаточно, чтобы проанализировать вариации числа копий. Если разделить геном на сегменты и подсчитать, как много коротких ридов приходится на каждый, «вы получаете очень надежную оценку, позволяющую обнаружить амплификации или делеции, гетерозиготность или даже более крупномасштабные изменения числа копий», — объясняет Майкл Шатц. Но для этого нужны миллионы независимых чтений. Шатц подчеркнул, что в этом случае не надо гнаться за точностью прочтения каждого нуклеотида: «То, как вы находите эти варианты количества копий с помощью секвенирования, — это в первую очередь упражнение в счете».

Авторы работы проанализировали CNA в линии клеток рака молочной железы SK-BR-3 и семи образцах острого миелоидного лейкоза (AML): пять с нормальным кариотипом и два — с комплексным (CK-AML), при котором прогноз хуже. Секвенирование проводили на приборе MinION, ДНК клеток фрагментировали с помощью ультразвука до средней длины 400 п.н. (вместо обычных для нанопора 10 т.п.н.). Так удалось в 4-6 раз увеличить возврат одиночных секвенированных молекул. При этом можно было увеличить количество одновременно секвенируемых образцов, чтобы уменьшить время анализа и затраты. А если нужен анализ с более высоким разрешением, то можно секвенировать меньше образцов, но обеспечить большую глубину секвенирования.

Образцы SK-BR-3 и AML также секвенировали с использованием стандартных протоколов Illumina, чтобы сравнить результаты. Нанопоровое секвенирование коротких молекул на устройстве MinION показало число копий так же точно, как и секвенирование Illumina. Однако нанопоровое секвенирование более доступное и портативное, и использовать его выгоднее. Еще более экономичным его делает адаптер Flongle для MinION и других приборов ONT.

Авторы отмечают, что нанопоровое секвенирование коротких фрагментов ДНК может использоваться очень широко — не только для определения числа копий генов и диагностики рака. Недавно они разработали алгоритм для обогащения конкретных локусов в данных нанопорового секвенирования, и этот алгоритм в сочетании с короткомолекулярным секвенированием позволит исследовать весь репертуар генетических изменений в соматических клетках и клетках зародышевой линии, считают они.

Цитируется по: 

Basilian T. et al. High resolution copy number inference in cancer using short-molecule nanopore sequencing, published September 22, 2021, DOI: 10.1093/nar/gkab812.

Источник: https://pcr.news

15.11.2021

Ajax Call Form
Loading...
Translate »