Определение связывания с белками микросом печени

Цель исследования — определение свободной фракции тестируемого соединения в микросомах (FuMic) в процессе равновесного диализа. Степень связывания соединений с белками микросом существенно влияет на клиренс и время полужизни исследуемого препарата, учитывается при расчете печеночного клиренса in vivo. Таким образом, данные FuMic необходимы для прогнозирования фармакокинетических параметров лекарственных кандидатов.

Краткое описание метода

Для определения связывания с белками микросом используют пулированные фракции микросом в фосфатном буфере. Тест проводится в 48-луночном планшете с тефлоновым покрытием, предназначенном для диализа. Каждая лунка содержит две отдельных камеры, разделенные вертикальной полупроницаемой диализной мембраной с порами 8 кДа. Суспензия микросом в концентрации 0,25 мг/мл с тестируемым соединением в концентрации 0,5 мкМ вводится в одну из камер, в другую камеру помещают буферный раствор с рН=7,4. С течением времени при 37˚С и покачивании происходит пассивная диффузия несвязанного соединения и через 4 ч достигается состояние равновесия между камерами с микросомами и с буферным раствором. Количество свободной фракции оценивается с помощью ВЭЖХ-МС/МС после преципитации белков ацетонитрилом. Несвязанная фракция (Fu) вычисляется как отношение концентрации на стороне буфера к концентрации на стороне микросом. В ходе исследования также по массовому балансу оценивается стабильность вещества в течение 4 ч и пассивная проницаемость через диализную мембрану в буфере. Контрольные соединения – пропранолол (среднее связывание), варфарин (низкое связывание), нелфинавир (высокое связывание). По требованию клиента в протоколе могут быть использованы микросомы различных видов (человек, крыса, мышь, собака, обезьяна или кролик) и дополнительные контрольные соединения.

Протокол определения связывания с белками микросом печени