Разработана новая система управления синтетическими генами

Используя подход, основанный на белках CRISPR, исследователи Массачусетского технологического института (Massachusetts Institute of Technology, MIT) разработали новый способ точного контроля количества определенного белка, вырабатываемого в клетках млекопитающих. Новый метод можно широко использовать для тонкой настройки производства полезных белков, таких как моноклональные антитела, применяемых для лечения рака и других заболеваний, либо других аспектов клеточного поведения. В своем новом исследовании, опубликованном в журнале Nature Communications, ученые показали, что созданная ими система работает в различных клетках млекопитающих с очень стабильными результатами.

«Это очень предсказуемая система, которую мы можем разработать заранее, а затем получить ожидаемый результат», — говорит Уильям Чен (William C.W. Chen), бывший научный сотрудник MIT. «Это очень настраиваемая система, подходящая для многих различных биомедицинских приложений в разных типах клеток».

Чен, сейчас работающий профессором биомедицины в Университете Южной Дакоты, является одним из ведущих авторов нового исследования, наряду с бывшим научным сотрудником MIT Леонидом Гайдуковым и постдоком Йонг Лаем. Старший автор Тимоти Лу руководил исследованием в качестве адъюнкт-профессора биологической инженерии, электротехники и компьютерных наук MIT.

Генный контроль

Многие терапевтические белки, в том числе моноклональные антитела, производятся в больших биореакторах, содержащих клетки млекопитающих, сконструированные для получения желаемого белка. Несколько лет назад исследователи из Центра синтетической биологии Массачусетского технологического института, включая лабораторию Лу, начали работать с Pfizer Inc. над проектом по разработке инструментов синтетической биологии, которые можно было бы использовать для увеличения производства этих полезных белков.

Для этого исследователи нацелились на промоторы генов, которые они хотели активировать. Во всех клетках млекопитающих гены имеют промоторную область, которая связывается с факторами транскрипции — белками, инициирующими транскрипцию гена в информационную РНК.

Ранее эти же ученые разработали синтетические факторы транскрипции, в том числе белки, называемые «цинковыми пальцами», активирующие гены-мишени. Однако «цинковые пальцы» и большинство других типов синтетических факторов транскрипции должны быть «подработаны» для каждого гена, на который они нацелены, что делает такую разработку весьма сложной и трудоемкой.

В 2013 году исследователи из лаборатории Лу разработали фактор транскрипции на основе CRISPR, позволивший им существенно легче контролировать транскрипцию встречающихся в природе генов в клетках млекопитающих и дрожжей. В новом исследовании ученые намеревались развить эту работу, чтобы создать библиотеку синтетических биологических частей, а те позволили бы им доставлять трансген — ген, который обычно не экспрессируется клеткой, — и точно контролировать его экспрессию.

 «Идея состоит в том, чтобы иметь синтетическую промоутерную систему полного спектра, которая может варьироваться от очень низкой до очень высокой, чтобы соответствовать различным клеточным приложениям», — рассказывает Чен.

Система, которую в итоге разработали исследователи, включает в себя несколько компонентов. Одним из них является транскрибируемый ген вместе с «операторной» последовательностью, состоящей из ряда сайтов связывания искусственных транскрипционных факторов. Другим компонентом является направляющая РНК, связывающаяся с этими операторными последовательностями. Наконец, система также включает домен активации транскрипции, присоединенный к деактивированному белку Cas9. Когда последний связывается с направляющей РНК в синтетическом промоторном сайте, фактор транскрипции на основе CRISPR может включать экспрессию гена.

Промоторные сайты, используемые для этой синтетической системы, разработали таким образом, чтобы они отличались от встречающихся в природе промоторных сайтов, поэтому система не будет влиять на гены в собственных геномах клеток. Каждый оператор включает от 2-х до 16-ти копий сайта связывания направляющей РНК, причем, исследователи обнаружили, что их система может инициировать транскрипцию генов со скоростью, линейно соответствующей количеству сайтов связывания. А это позволяет разработчикам точно контролировать количество продуцируемого белка, что является важнейшим моментом процесса.

Высокая консистенция

Исследователи протестировали свою систему на нескольких типах клеток млекопитающих, в том числе – на клетках яичника китайского хомяка (CHO), обычно использующихся для производства терапевтических белков в промышленных биореакторах. Они обнаружили очень похожие результаты в клетках CHO и других протестированных ими клетках, включая миобласты мыши и крысы (предшественники мышечных клеток), эмбриональные клетки почек человека и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки.

«Система имеет очень высокую согласованность по разным типам клеток и разным генам-мишеням», — говорит Чен. «Это хорошая отправная точка для размышлений о регулировании экспрессии генов и поведения клеток с помощью хорошо настраиваемой и предсказуемой искусственной системы».

После первой демонстрации того, что новую систему можно использовать для побуждения клеток к производству ожидаемого количества флуоресцентных белков, исследователи показали, что они также могут использовать ее для программирования производства двух основных сегментов моноклонального антитела, известного как JUG444.

Исследователи также запрограммировали клетки СНО на выработку различных количеств человеческого антитела, называемого анти-PD1. Когда человеческие Т-клетки подвергались воздействию этих клеток, они становились более мощными убийцами опухолевых клеток, если производилось большее количество антител.

Хотя ученые смогли получить высокий выход желаемых антител, по их словам, потребуется дальнейшая работа для включения этой системы в промышленные процессы. В отличие от клеток, используемых в промышленных биореакторах, клетки, использованные в данном исследовании, выращивались на плоской поверхности, а не в жидкой суспензии.

«Это – система, обещающая быть использованной в промышленных целях, но сначала мы должны адаптировать ее к взвешенным клеткам, чтобы посмотреть, производят ли они белки таким же образом. Я уверен, что это должно быть то же самое, поскольку не видны причины, по которым этого не должно быть, но нам все равно нужно все проверить», — говорит Чен.

Исследование получило очень высокую оценку и поэтому широко финансировалось  Программой синтетической биологии Pfizer-MIT RCA, Национальным научным фондом, Национальными институтами здравоохранения, Медицинской школой Сэнфорда Университета Южной Дакоты, постдокторской стипендией NIH Ruth L. Kirschstein NRSA и Министерством здравоохранения США.

Источник: https://www.eurekalert.org/

2.11.2022