Доклинические модели in vivo ревматоидного артрита, индуцированного коллагеном

Коллаген-индуцированный артрит (CIA)

Оценка терапевтической эффективности и безопасности нового препарата или метода лечения в модели ревматоидного артрита, индуцированного коллагеном II в адъюванте Фрейнда.

Данная методика позволяет исследовать активность новых лекарственных препаратов на модели хронического иммунного воспаления (коллаген-индуцированного артрита) у мышей и крыс.

Дизайн исследования

Воспалительную реакцию вызывают подкожным введением в основание хвоста раствора коллагена в неполном адъюванте Фрейнда.

Внешний осмотр конечностей и оценку степени развития артрита проводят 2 раза в неделю, после появления признаков артрита – каждые 2 дня. Также возможно измерение объема задних конечностей плетизмометром.

В конце исследования проводят гистологическую оценку коленных (скакательных) суставов и стоп животных.

Животные

• Вид: линии мышей или крыс, чувствительные к индукции артрита коллагеном II.

• Пол: Обычно используют самцов, так как у них более стабильная и выраженная реакция на индукцию артрита. Допустимо использование самок, поскольку в клинической практике у женщин ревматоидный артрит встречается в 3 раза чаще, чем у мужчин.

• Возраст: 6–8 недель.

• Вес: 18–22 г (для мышей).

• Условия содержания: Стандартные условия вивария, свободный доступ к воде и корму.

• Количество групп:

  • Группа 1: Контроль (здоровые животные, без индукции артрита).

  • Группа 2: Отрицательный контроль (животные с индуцированным артритом, без лечения).

  • Группа 3: Положительный контроль (животные с индуцированным артритом, получающие стандартное лечение, например, метотрексат).

  • Группа 4-6: Опытная группа (животные с индуцированным артритом, получающие исследуемый препарат в дозе X, Y, Z).

• Количество животных в группе: 8–10 (для обеспечения статистической значимости).

Индукция артрита

• Коллаген II: Раствор коллагена II типа (например, 2 мг/мл) в 0,1 М уксусной кислоте.

•  Смесь коллагена II.

• Иммунизация:

  • День 0: Инъекция 100 мкл эмульсии (коллаген II ) внутрикожно в основание хвоста.

  • День 21: Бустерная инъекция 100 мкл эмульсии (коллаген II) внутрикожно.

Визуальная оценка развития артрита

Для оценки степени развития артрита используют бальную шкалу:

1) проводят визуальную оценку степени развития артрита левой и правой задних конечностей

2) для одного животного суммируют значения, полученные для правой и левой конечностей

3) складывают суммарные значения по каждому животному.

Шкала визуальной оценки (по Rosloniec et al., 2010, Curr Prot in Immun):

Биохимические маркеры:

• Цитокины: Уровень провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β, IL-6) в сыворотке крови (метод ELISA).

• Антитела к коллагену II: Уровень антител в сыворотке крови (метод ELISA).

Гистологический анализ

• • Воспаление (0–3 балла).

  • Деструкция хряща (0–3 балла).

  • Деструкция кости (0–3 балла).

Оценка безопасности

Стандартные клинико-лабораторные, физиологические и патоморфологические методы оценки

Ожидаемые результаты

• Снижение клинических и гистологических признаков артрита в опытной группе по сравнению с отрицательным контролем.

• Уменьшение уровня провоспалительных цитокинов и антител к коллагену II.

• Отсутствие токсических эффектов препарата (нормальные показатели крови и массы органов)

Пример исследования

Исследование проведено на крысах линии Sprague-Dawley. Представлены частота заболеваемости артритом (% отношения числа крыс с проявлениями артрита к общему числу иммунизированных крыс) и бальная оценка развития артрита.

На фотографиях стрелками отмечены поражения суставов крысы при ревматоидном артрите (окрашивание гематоксилином-эозином):

• воспалительная инфильтрация стромы лейкоцитами, плазматическими клетками и макрофагами, разрастание фиброзной ткани (рис. 1);
• образование паннуса (рис.2, А) – пласта грануляционной ткани с воспалительным инфильтратом, разрушающего и замещающего суставной хрящ;
• пролиферация синовиоцитов (рис.2, Б);

По согласованию с Заказчиком возможны дополнительные методы оценки патологии, например, оценка выраженности болевого синдрома, анализ содержания специфических маркеров патологии, фармакокинетические исследования на животных с патологией.