Протокол изучения токсикокинетики лекарственных кандидатов in vivo на мышах и крысах в виварии ХимРар

Токсикокинетика (ТК) — это раздел токсикологии, который изучает, как организм воздействует на лекарственное вещество в условиях токсических доз. ТК-исследования позволяют оценить связь между дозой, концентрацией препарата в организме и его токсичностью. Ниже представлен подробный протокол для изучения токсикокинетики лекарственных кандидатов на мышах и крысах в условиях вивария.

1. Подготовка к эксперименту

1.1. Выбор животных

• Мыши: Линии C57BL/6, BALB/c или другие, в зависимости от целей исследования.

• Крысы: Линии Sprague-Dawley, Wistar или другие.

• Возраст: 8–12 недель.

• Пол: Обычно используют самцов для минимизации гормональных колебаний, но пол может варьироваться в зависимости от целей исследования.

• Количество животных: Минимум 6 животных на группу для обеспечения статистической значимости.

1.2. Условия содержания

• Животные содержатся в стандартных условиях вивария:

  • Температура: 20–24 °C.

  • Влажность: 60–80%.

  • Световой цикл: 12 часов света/12 часов темноты.

  • Свободный доступ к воде и стандартному корму.

1.3. Подготовка препарата

• Препарат растворяют в подходящем растворителе (например, физиологический раствор, DMSO, PEG-400).

• Концентрация и объём введения рассчитываются на основе массы тела животного.

• Дозы выбираются на основе данных о токсичности (например, LD50) и предварительных фармакокинетических исследований.

2. Введение препарата

2.1. Пути введения

• Внутривенный (IV): Инъекция в хвостовую вену (мыши) или яремную вену (крысы).

• Пероральный (PO): Введение через зонд или добровольное потребление с кормом.

• Подкожный (SC), внутрибрюшинный (IP), внутримышечный (IM): Альтернативные пути введения, если необходимо.

2.2. Дозировка

• Используются токсические дозы, которые могут вызывать побочные эффекты, но не приводят к немедленной гибели животных.

• Пример: 1x, 3x, 10x терапевтической дозы.

3. Сбор образцов

3.1. Временные точки

• Временные точки для сбора образцов зависят от ожидаемой токсикокинетики препарата. Обычно:

  • Ранние точки: 5, 15, 30 минут.

  • Промежуточные точки: 1, 2, 4, 6 часов.

  • Поздние точки: 8, 12, 24, 48 часов.

3.2. Типы образцов

• Кровь: Сбор из ретроорбитального синуса, хвостовой вены или сердца (терминальный забор).

  • Объём: 50–100 мкл для мышей, 200–500 мкл для крыс.

  • Кровь центрифугируют для получения плазмы или сыворотки.

• Моча и фекалии: Сбор в метаболических клетках.

• Ткани: Печень, почки, мозг, лёгкие, сердце, селезёнка для оценки распределения и накопления.

4. Анализ образцов

4.1. Подготовка образцов

• Плазму/сыворотку, мочу и тканевые гомогенаты обрабатывают для экстракции препарата и его метаболитов (например, методом осаждения белков, жидкостной экстракции).

4.2. Методы анализа

• Жидкостная хроматография с масс-спектрометрией (LC-MS/MS): Наиболее распространённый метод для количественного анализа.

5. Оценка токсичности

5.1. Клинические наблюдения

• Ежедневно регистрируют:

  • Массу тела.

  • Потребление воды и корма.

  • Поведенческие изменения (вялость, агрессия).

  • Внешние признаки токсичности (выпадение шерсти, язвы, отёки).

5.2. Биохимические и гематологические анализы

• Кровь: Оценка показателей печени (АЛТ, АСТ, билирубин), почек (креатинин, мочевина), гематологических параметров (лейкоциты, эритроциты, тромбоциты).

• Моча: Анализ белка, глюкозы, осадка.

5.3. Гистологический анализ

• После завершения эксперимента проводят вскрытие и забор тканей для гистологического исследования.

• Ткани фиксируют в формалине, готовят срезы и окрашивают гематоксилином и эозином (H&E).

6. Обработка данных

6.1. Токсикокинетические параметры

• Cmax: Максимальная концентрация препарата в плазме.

• Tmax: Время достижения Cmax.

• AUC (Area Under Curve): Площадь под кривой «концентрация-время».

• t1/2: Период полувыведения.

• Cl (клиренс): Скорость выведения препарата.

• Vd (объём распределения): Гипотетический объём, в котором распределяется препарат.

6.2. Корреляция с токсичностью

• Анализируют связь между концентрацией препарата в тканях/плазме и наблюдаемыми токсическими эффектами.

6.3. Программное обеспечение

• Для расчёта параметров используются программы, такие как Phoenix WinNonlin.

7. Этические соображения

• Эксперименты должны быть одобрены локальным этическим комитетом.

• Минимизация страданий животных: использование анестезии при забое, гуманные методы сбора образцов.

• Соблюдение принципов 3R (Replacement, Reduction, Refinement).

8. Пример эксперимента

• Цель: Изучение токсикокинетики нового противоопухолевого препарата.

• Модель: Крысы Sprague-Dawley.

• Доза: 50 мг/кг внутривенно.

• Временные точки: 5, 15, 30 минут; 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 часов.

• Образцы: Плазма, печень, почки.

• Анализ: LC-MS/MS, биохимические и гистологические исследования.

Данный протокол позволяет оценить токсикокинетику лекарственного кандидата in vivo, выявить потенциальные риски и установить безопасные дозы для дальнейших исследований. Результаты токсикокинетических исследований являются важной частью доклинической оценки безопасности новых препаратов.