Тест на определение термодинамической растворимости

Термодинамическая растворимость определяется как концентрация вещества в насыщенном растворе, когда достигнуто термодинамическое равновесие между растворенным веществом и растворителем. На практике, истинное термодинамическое равновесие может быть измерено посредством длительной инкубации (24-72 часа) навески препарата в растворителе — метод встряхивания флакона (shake-flask).

Подход встряхивания флакона используется для измерения термодинамической растворимости в воде, буферах с различным pH. Насыщенный раствор образуется в течение 24ч инкубации, на что указывает избыток нерастворенного материала. Затем образец фильтруется и определяется концентрация соединения в фильтрате. Риск получения сверхнасыщенного раствора является низким и определяется растворимость стабильной формы соединения.

Краткое описание метода

В методе встряхивания флакона тестируемое соединение встряхивается в интересующем растворителе до тех пор, пока не образуется стойкая нерастворенная форма соединения. Соединение добавляется в избытке (1-20 мг) к 1 мл универсального буфера (УБ) pION с желаемым pH (pH 2, 4 и pH 7) в стеклянном флаконе и получившая суспензия инкубируется на вращающемся смешивателе при комнатной температуре до достижения равновесия (24ч), затем фильтруется через 96-луночный планшетный фильтр Millipore’s MultiScreen Solubility Filter. Опционально, соединение может быть растворено в фосфатносолевом буфере, pH 7,4, в УБ pION pH 7,4 или в деионизованной воде. Фильтрат разводится соответствующий буфером для анализа. Для количественного определения растворимости с помощью ВЭЖХ-МС/МС или спектрофотометрии, строится стандартная калибровка тестируемого соединения.

Диапазон концентраций калибровочной кривой включает в себя 8 точек: 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25,

3.125 и 0 мкМ (для измерения методом спектрофотометрии) 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0,03125, 0.016 и 0 мкМ (для измерения методом ВЭЖХМС/МС).

Процент ДМСО – 2% (для измерения методом спектрофотометрии) или 0,2% (для измерения методом ВЖХ-МС/МС). Контрольные соединения: гидрокортизон, дипиридамол и диклофенак (по выбору).

Протокол теста на определение термодинамической растворимости