Исследование ингибирования цитохромов (флуоресцентный метод)

Экспериментальный метод по изучению ингибирования цитохромов печени входит в панель тестов АДМЕ. Несмотря на разнообразие изоферментов цитохрома в организме человека, биотрансформация лекарственных средств происходит с участием преимущественно ограниченного количества основных представителей семейства P450: CYP1А2, CYP2С9, CYP2С19, CYP2D6 и CYP3A4. Более редкими являются изоформы 2Е1, 2В6, 1В1, 2С8 и другие. Знание особенностей метаболизма лекарственного средства определенными изоформами системы цитохрома Р450 является необходимым при прогнозировании возможных нежелательных явлений, вызванных лекарственным взаимодействием, которые могут приводить к изменению концентрации лекарственного средства или его метаболитов (включая активные или токсические метаболиты) в плазме крови, а, следовательно, в области молекул-мишеней. Для оценки влияния препаратов на активность цитохромов печени в процессе разработки лекарств широко используются тест- системы с рекомбинантными ферментами и флуоресцентными субстратами, а также микросомы с метаболическими субстратами и ВЭЖХ-МС/МС анализ.

Краткое описание метода

Цель исследования — определение влияния соединения на активность основных изоформ цитохромов Р450 – 1А2, 2С9, 2С19, 2D6, 3А4, 2Е1, 2В6 при помощи тест-систем Invitrogen с флуоресцентными субстратами. Одним из наиболее быстрых и удобных методов тестирования большого ряда соединений на ингибирование цитохромов является флуоресцентный метод с использованием Vivid® CYP450 Screening Kits фирмы Invitrogen. Данные флуоресцентные киты разработаны для каждой изоформы цитохрома, основаны на взаимодействии рекомбинантных ферментов (CYP450 Baculosomes®) и их специфических флуоресцентных субстратов (Vivid® Substrates). В результате метаболической реакции субстраты переходят в сильно флуоресцирующие продукты, которые детектируются флюориметром. Снижение флуоресцентного сигнала говорит о степени ингибирования активности цитохрома. Тестируемые вещества в концентрации 0,005-10 мкМ инкубируются с рекомбинантными ферментами, субстратами и системой регенерации НАДФН в 384- луночных планшетах. Измеряется флуоресценция продукта реакции, пропорциональная активности цитохрома, в результате определяют значения IC50. В качестве контролей применяются известные специфические ингибиторы.

Протокол исследования ингибирования цитохромов (флуоресцентный метод)

Наборы

Vivid® CYP450 Screening Kits (Invitrogen)

Изоформы CYP450

1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4 (по требованию панель

изоформ может быть расширена 2С8, 2E1, 2В6 и др)

Концентрация соединения

Число повторов

0,005-10 мкМ (8 концентраций)

2 на концентрацию

Концентрация ДМСО

Кофактор

1 %

НАДФН

Флуоресцентные субстраты

EOMCC, BOMCC, DBOMF, BOMF (любые из тест-

систем Invitrogen)

Метод анализа

Флуориметрия

 

 

 

Контроли

мин — 100% ингибирования (без ферментов); макс — 0% ингибирования (смесь фермента,

субстрата и кофакторов в буфере с 1% ДМСО);

 

специфические ингибиторы (8 концентраций):

кетоконазол (3A4), хинидин (2D6), α-нафтофлавон (1A2), миконазол (2C19, 2В6), сульфафеназол (2C9), 4-метилпиразол (2E1)

 

Анализируемые параметры

-% ингибирования;

— IC50 — концентрация, при которой активность

фермента снижается на 50%

 

Число соединений в плашке

1) 8 соединений в 8 концентрациях, включая контрольный ингибитор;

2) 14 соединений в 4 концентрациях плюс контрольный ингибитор в 8 концентрациях.

ДЛЯ ЗАКАЗА ИССЛЕДОВАНИЙ:

Сизюхин Андрей Владимирович

Руководитель отдела продаж R&D сервисов, доклинические исследования

E-mail: sa@chemrar.ru

Тел.: +7 (495) 925-30-74 +доб.(538)

ОТПРАВИТЬ ЗАЯВКУ

    Ajax Call Form
    Loading...
    Translate »