Исследование кардиотоксичности

Метод используется для предсказания кардиотоксичности препарата по связыванию с hERG-каналами сердца in vitro. Ген специфических калиевых каналов (К+ -каналов) сердца человека (ген hERG, human ether-a- go-go-related gene) кодирует белки калиевых каналов, согласованная работа которых играет ключевую роль в процессе сердцебиения и определяет форму и длительность потенциала действия в клетках сердечной мышцы. Блокировка hERG– каналов сердца приводит к смертельно опасным последствиям: нарушению реполяризации миокарда, увеличению продолжительности QT интервала и желудочковой тахиаритмии. Уникальной особенностью этих каналов является их относительно быстрая инактивация вследствие высокой чувствительности к внеклеточным катионам, а также медленная активация и деактивация. Эта комбинация воротных механизмов приводит к изменению свойств канала. По-видимому, за счет этой высокой чувствительности можно объяснить, почему множество химических соединений избирательно блокируют именно hERG-каналы.

Определение влияния препаратов на hERG-каналы сердца проводится с помощью in vitro тест-системы Predictor hERG FP Assay, основанной на методе анализа по поляризации флуоресценции. Этот конкурентный и гомогенный метод иммуноанализа без стадий разделения и промывки является одним из наиболее перспективных в фармацевтической индустрии, поскольку обладает высокой специфичностью, чувствительностью, относительно низкой стоимостью и простотой проведения анализа. Метод основан на изменении деполяризации излучаемого света в результате быстрого вращения небольших флуоресцентных молекул (трейсеров). Если трейсер связывается с большой молекулой и тем самым увеличивает ее молекулярный объем, то вращение крупной молекулы замедляется, и излучаемый свет остается в той же плоскости, в которой он был возбужден. Изменение поляризации измеряется с помощью микропланшетного ридера, флуоресценция измеряется с помощью фильтров поляризованного возбуждения и эмиссии. Два измерения проводятся для каждой лунки. Измеряют флуоресценцию перпендикулярной плоскости возбуждения (“P-канал”) и флюоресценцию параллельной плоскости возбуждения (“S-канал”). По данным Predictor™ hERG FP Assay получают профили фармакологической безопасности веществ для калиевых каналов hERG (исследование IC50).

Краткое описание метода

Для анализа используется мембранная фракция, содержащая белок hERG–каналов (Predictor hERG Membrane) и обладающая высоким сродством к красному флуоресцентному лиганду канала hERG — трейсеру (Predictor™ hERG Tracer Red). Когда трейсер связан с белком, то производит высокую флуоресцентную поляризацию. Конкуренты (например, E4031 или тестируемые соединения), которые привязываются к белку hERG–каналов, вытесняют трейсер. Освобожденный трейсер мешает выделению деполяризованного света относительно источника возбуждения, поляризация уменьшается. Чем ниже значение поляризации, тем большее сродство имеет конкурент к белку hERG-канала.

Протокол теста на определение связывания с hERG-каналами сердца